4.4.1 SECUENCIACIÓN DEL ADN
La secuenciación de ADN es un conjunto de métodos y técnicas bioquímicas cuya finalidad es la determinación del orden de los nucleótidos (A, C, G y T) en un oligonucleótido de ADN. La secuencia de ADN constituye la información genética heredable del núcleo celular, los plásmidos, la mitocondria y cloroplastos (En plantas) que forman la base de los programas de desarrollo de los seres vivos.
Así pues, determinar la secuencia de ADN es útil en el estudio de la investigación básica de los procesos biológicos fundamentales, así como en campos aplicados, como la investigación forense. El desarrollo de la secuenciación del ADN ha acelerado significativamente la investigación y los descubrimientos en biología. Las técnicas actuales permiten realizar esta secuenciación a gran velocidad, lo cual ha sido de gran importancia para proyectos de secuenciación a gran escala como el Proyecto Genoma Humano. Otros proyectos relacionados, en ocasiones fruto de la colaboración de científicos a escala mundial, han establecido la secuencia completa de ADN de muchos genomas de animales, plantas y microorganismos.
En el método químico un fragmento de DNA se marca en uno de sus extremos con P o S radiactivo por acción de la enzima polinucleótido quinasa. Ambos extremos se separan por la acción de una enzima de restriccion. El paso siguiente consiste en romper estos fragmentos, no más de una o dos veces por molécula, con reacciones químicas específicas para cada una de las cuatro bases. Haremos cuatro alícuotas y trataremos cada una de ellas con un compuesto químico que modifique una de las cuatro bases, aproximadamente una vez por molécula de DNA. El tratamiento posterior con piperidina producirá la rotura de la cadena allí donde la base había sido alterada.
Especificidad
Base Reactivo
G Dimetil sulfoxido
G+A Acido fórmico
T Permanganato Potásico
C Hidroxilamina
Posteriormente se analizan los fragmentos en geles desnaturalizantes.
En algunos casos especiales, las letras seguidas de A, T, C, y G se presentan en una secuencia. Esas letras representan ambiguedad. De todas las moléculas muestreadas, hay más de una clase de nucleótidos en esa posición. Las reglas de la Unión Internacional de Química Pura y Aplicada (IUPAC) son las que siguen:
- A = adenina
- C = citosina
- G = guanina
- T = timina
- R = G A (purina)
- Y = T C (pirimidina)
- K = G T (keto)
- M = A C (amino)
S = G C (enlaces fuertes)
- W = A T (enlaces débiles)
- B = G T C (todos y A)
- D = G A T (todos y C)
- H = A C T (todos y G)
- V = G C A (todos y T)
- N = A G C T (cualquiera)
BIBLIOGRAFIA:
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